【摘要】

探讨口服鼠李糖乳杆菌对早产儿肠道菌群、免疫及胃肠道功能的影响。

方法

选取2018年4~10月生后24 h内收住华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿科、胎龄<34周且出生体重<2500g的早产儿进行前瞻性研究。根据入选顺序单双号分为对照组和观察组。生后第1天起观察组给予鼠李糖乳杆菌溶液（4×109 CFU/ml，0.25 ml/d）、对照组给予等量玉米油口服，疗程30 d。收集第21天和第42天新鲜粪便进行16S rDNA测序分析；同时检测生后第1天和第42天血免疫球蛋白、淋巴细胞亚群、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）水平。

结果

最终完成29例，其中对照组15例、观察组14例。生后第21天观察组肠道乳杆菌属比例高于对照组（P<0.05），第42天观察组肠道链球菌属比例低于对照组（P<0.05）。第21天观察组检测物种数指数大于对照组（P<0.05），第42天两组各指数差异无统计学意义（P>0.05）。两组出生第1天、第42天血免疫球蛋白水平差异均无统计学意义（P>0.05）；与第1天相比，两组第42天IgM均上升、IgG均下降（P<0.05）。与第1天相比，观察组第42天NK细胞、B细胞、CD3+ T细胞和CD4+ T细胞计数明显升高（P<0.05），对照组第42天B细胞、CD3+ T细胞和CD8+ T细胞计数明显升高（P<0.05）；生后第1天及第42天两组NK细胞及各淋巴细胞计数差异均无统计学意义（P>0.05）。与第1天相比，第42天对照组IFN-γ水平下降（P<0.05），观察组上升（P<0.05）；IL-4水平差异无统计学意义（P>0.05）。观察组发生喂养不耐受4例，对照组9例，差异无统计学意义（P>0.05）。

结论

生后早期补充鼠李糖乳杆菌能够调节早产儿肠道菌群组成，增加乳杆菌属，减少链球菌属，可能减少喂养不耐受的发生、促进NK细胞和CD4+ T细胞增殖，激活淋巴细胞表达IFN-γ。

全球每年出生的新生儿中早产儿占11%左右［1］，早产儿先天性免疫应答和适应性免疫应答不足，IgG水平降低，调理和吞噬作用降低，Th1细胞相对于Th2细胞的激活增强［2］。而且早产儿生后入住新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit，NICU）接受呼吸、营养等支持以及抗生素治疗的几率更高，其肠道正常菌群的建立面临更严峻的挑战。肠道菌群作为一种重要的肠道刺激因素，与免疫系统的发育和成熟密不可分［3］，在肠道屏障、消化吸收、营养代谢、肠道免疫及机体免疫方面起着重要作用。益生菌能够改善机体的肠屏障功能，激活巨噬细胞、自然杀伤（natural killer， NK）细胞、T淋巴细胞，调节细胞因子分泌，强化非特异性细胞免疫反应［4］。鼠李糖乳杆菌作为一种常用的益生菌，耐胆盐、耐胃酸、定植时间长，能减少坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）的发生和改善早产儿预后［5］，但其对早产儿肠道菌群和免疫的作用并不十分清楚。本研究主要通过对早产儿粪便肠道菌群组成、外周血免疫指标及胃肠道症状发生情况进行分析，探讨生后早期口服鼠李糖乳杆菌对早产儿肠道微生态和免疫功能的影响。

对象和方法

一、研究对象

选取2018年4~10月生后24 h内收住我院新生儿科、胎龄<34周且出生体重<2 500 g的早产儿进行前瞻性研究。排除标准：母孕期使用过抗生素、微生态制剂或者免疫抑制剂；出生时有严重窒息、感染；有先天性消化道畸形、先天性免疫缺陷及各种遗传代谢病；不能耐受胃肠道给药；住院期间因各种原因放弃治疗；依从性差，未按规定时间随访；研究期间使用过抗生素；出院后私自停服或加服其他益生菌；因各种原因未能完成本研究。入选患儿按顺序排序，单号为对照组，双号为观察组。本研究通过我院伦理委员会批准（TJ-IRB20210401），患儿父母均签署知情同意书。

二、研究方法

1.干预方法：观察组自出生第1天起给予鼠李糖乳杆菌溶液（美国莱思纽卡，菌株号：ATCC 53103，4×109 CFU/ml）口服，由专人早上9点给药，0.25 ml/d，连续30 d；对照组自出生后第1天起给予等量玉米油（美国莱思纽卡）口服。日龄不满30 d出院的早产儿在家中继续相应喂养直至满30 d。

莱思纽卡鼠李糖益生菌

2.粪便标本采集和16S rDNA测序：生后第21天和第42天分别收集两组早产儿新鲜粪便1~2 g。采集过程尽可能严格无菌、快速，之后立即放置在-80 ℃冰箱贮存。对每个样本进行16S rDNA测序，分析各菌种所占百分比，同时计算α多样性指数，包括均匀度指数（evenness）、谱系多样性指数（faith_pd）、检测物种数指数（observed species）和香农指数（shannon）。由北京艾德范思医学检验实验室有限公司完成。

3.血标本采集和检测：两组早产儿生后第1天、第42天分别采静脉血2 ml，用于检测免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量（BeckmanCoulter公司，UniCel DxI 800分析仪）和淋巴细胞亚群计数（BD公司，FACSCantoTMⅡ流式细胞仪），以及酶联免疫吸附法检测血清细胞因子干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）表达水平（试剂盒购自北京欣博盛生物科技公司）。

4.资料收集：记录患儿性别、胎龄、出生体重、分娩方式、喂养方式和胃肠道症状（呕吐、腹胀、胃潴留、喂养不耐受［6］、坏死性小肠结肠炎［7］）的发生情况。

三、统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用秩和检验，组内比较采用Wilcoxon符号秩检验；计数资料以例数表示，组间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

研究期间共收治生后24 h内入院、胎龄<34周、出生体重<2 500 g且家长同意参加本研究的早产儿共60例，对照组和观察组各30例。对照组因使用抗生素10例、外地不来随访2例、无第42天随访1例、服用其他益生菌2例，共排除15例；观察组因使用抗生素12例、外地不来随访2例、无第42天随访2例，共排除16例。最终共完成29例，其中对照组15例、观察组14例。两组性别、胎龄、出生体重、分娩方式、住院时间和喂养方式比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

二、肠道微生态

1.肠道菌群组成：生后第21天部分早产儿出院后加喂母乳，混合喂养增多，肠道菌群以梭菌属、肠球菌属、链球菌属为主；观察组肠道乳杆菌属含量高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。生后第42天两组早产儿以混合喂养为主，肠道菌群组成以韦容氏球菌属、梭菌属、链球菌属和乳杆菌属为主；观察组链球菌属比例低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.肠道菌群α多样性指数分析：生后第21天观察组检测物种数指数高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两组均匀度、谱系多样性和香农指数差异无统计学意义（P>0.05）；生后第42天两组均匀度、谱系多样性、检测物种数和香农指数差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

三、免疫球蛋白浓度

生后第1天及第42天两组IgA、IgM、IgG含量差异无统计学意义（P>0.05）；与第1天相比，两组第42天血清IgM含量上升，IgG含量下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

四、淋巴细胞亚群计数

观察组第42天NK细胞、B细胞、CD3+ T细胞和CD4+ T细胞计数明显升高，与第1天相比，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组第42天B细胞、CD3+ T细胞和CD8+ T细胞计数明显升高，与第1天相比，差异有统计学意义（P<0.05）。生后第1天及第42天两组NK细胞及各淋巴细胞计数差异均无统计学意义（P>0.05）。见表5。

五、血清IFN-γ和IL-4水平

与第1天相比，观察组第42天IFN-γ水平上升（P<0.001），对照组下降（P<0.01），两组水平差异有统计学意义（P<0.05）；两组IL-4水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表6。

六、胃肠道症状

观察组发生喂养不耐受4例（4/14），无NEC发生；对照组发生喂养不耐受9例（9/15），2例发生NEC。两组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

讨 论

益生菌能通过定植改变宿主胃肠道菌群组成，有利于宿主健康。近年研究表明，益生菌不仅可以减少早产儿胃肠道致病菌的定植，降低早产儿NEC发生率［8］，还可以促进全身免疫成熟［9］。应用益生菌可直接补充早产儿肠道内的生理菌群，维持肠道菌群平衡，增加胃泌素和胃动素的分泌，增强肠黏膜对致病因子的保护屏障［10］，还能对维持机体消化吸收、抗感染以及免疫调节等功能发挥作用［11］。本研究结果显示，观察组生后第21天肠道乳杆菌属比例高于对照组，第42天链球菌属比例低于对照组，提示生后早期口服鼠李糖乳杆菌可以促进早产儿肠道内乳杆菌属（有益菌）的定植，抑制链球菌属（潜在致病菌）的增殖。第42天两组乳杆菌属比例差异无统计学意义，可能因为随着服药30 d后停药，鼠李糖乳杆菌摄入减少，导致观察组肠道乳杆菌数量逐渐降至低水平。

α多样性是评价物种丰富度和复杂度的重要指标，肠道菌群失衡不仅参与了肠道疾病的病理过程，更导致了过敏性疾病、代谢性疾病及神经系统疾病的发生与发展。益生菌作为一种可能的干预措施，可以通过影响肠道微生态改善人类的健康状况［12］。本研究结果显示，第21天观察组检测物种数指数高于对照组，两组其他指数比较、第42天各指数比较，差异均无统计学意义，说明停药后鼠李糖乳杆菌对肠道菌群的调控作用消失，提示生后早期给予鼠李糖乳杆菌干预能够丰富早产儿肠道微生物多样性，对改善肠道微生态有积极影响。

有研究指出服用高剂量的鼠李糖乳杆菌（1010 CFU/d）能减少儿童腹泻持续时间及每日大便次数［13］。本研究中观察组喂养不耐受发生率（4/14）低于对照组（9/15），且无NEC发生，表明口服鼠李糖乳杆菌增加了肠内正常菌群的定植，刺激了早产儿胃肠蠕动功能，进而减少了胃肠相关疾病的发生，降低了NEC发生率，对预防胃肠道疾病有积极作用。因此，早期给予鼠李糖乳杆菌干预能够减少早产儿胃肠道疾病的发生。

新生儿免疫防御系统主要由适应性免疫和固有免疫组成，适应性免疫主要包括T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫［14］。NK细胞是固有免疫的重要组成部分，可以通过自身的细胞毒性（如分子穿孔素）直接消灭受感染的靶细胞，通过产生IFN-γ、IL-5、IL-10和IL-13等参与机体的免疫应答［15］。肠道菌群在先天性和适应性免疫调节中发挥作用，维持Th1和Th2免疫平衡，参与了过敏和自身免疫性疾病的发展［16］。而早产儿适应性免疫不成熟，在T细胞活化、细胞因子产生、B细胞分泌免疫球蛋白等方面均存在缺陷，早产儿IgA、IgM水平随日龄增加而逐渐升高，经胎盘从母体被动获得的IgG逐渐消耗使新生儿体内IgG水平随日龄增加而逐渐下降［17］。

本研究结果显示，生后第42天两组早产儿血清IgA、IgM及IgG含量差异无统计学意义；观察组第42天NK细胞、B细胞、CD3+ T和CD4+ T细胞计数明显升高（P<0.05），对照组在第42天B细胞、CD3+ T细胞和CD8+ T细胞计数明显升高（P<0.05），表明生后早期补充鼠李糖乳杆菌可以促进早产儿NK细胞和CD4+ T细胞的增殖。但两组第42天淋巴细胞计数差异并无统计学意义。体液免疫的建立是一个长期的过程，可能还需要对早产儿应用益生菌进行长期研究。Kent等［18］研究发现早产儿本身随日龄增多CD4+ T细胞降低，CD8+ T细胞增加，CD4+ T/CD8+ T比值下降，NK细胞逐渐增多。新生儿CD3+ T细胞和CD4+ T细胞比例接近成人，但有活性的成熟T细胞比例却低于儿童和成人，循环中多数为幼稚T细胞，分泌细胞因子能力低下［19］。

早产儿由于胸腺发育不成熟，Th1/Th2细胞功能失衡，细胞免疫和体液免疫更难维持正常［10］。IFN-γ广泛表达于T细胞和NK细胞，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调控的作用［20］，能客观反映机体免疫细胞的活化状态，属于Th1型细胞分泌的细胞因子；IL-4属于Th2型细胞分泌的细胞因子，是B细胞激活IgE的必需介导因子。鼠李糖乳杆菌可以通过提高IFN-γ、降低IL-4表达改善食物过敏小鼠的症状，维持肠黏膜完整和肠细胞有序排列［21］。本研究结果显示，与第1天相比，第42天对照组血IFN-γ水平下降，观察组上升，两组差异有统计学意义；而IL-4水平差异无统计学意义。说明鼠李糖乳杆菌能够活化Th1型细胞，促进IFN-γ分泌，增强细胞免疫功能。

综上所述，早产儿生后口服鼠李糖乳杆菌能够增进早产儿肠内乳杆菌属定植，抑制链球菌属增殖，丰富肠道菌群的多样性；还能促进NK细胞和CD4+ T细胞增殖，活化淋巴细胞表达IFN-γ，提高免疫功能；并且在降低早产儿喂养不耐受及NEC发生率方面可能有积极作用。但是本研究例数很少，还需大样本研究进一步探讨。

文献来源: 徐浩, 陈玲, 姜丽, 等. 口服鼠李糖乳杆菌对早产儿肠道菌群及免疫的影响 [J] . 中华新生儿科杂志, 2021, 36(3) : 14-19.